Контакты: (812) 336-80-84
меднавигатор.рф

Диагностика хеликобактериоза одноразовыми тест-системами по уреазной активности бактерии

Милейко В.Е., ООО «Синтана СМ», mileiko@mail.ru


С открытием этиопатогенной роли Helicobacter pylori (HP) стали развиваться на тот момент новые методы его диагностики. В качестве одного из них был предложен «дыхательный» метод диагностики хеликобактериоза, например urea breath test (UBT). Он был построен на оценке скорости гидролиза мочевины (1) меченой изотопными маркерами: радиоактивным   или стабильным . Меченая маркерами  или  мочевина принимается внутрь и по нарастанию содержания изотопов углерода  или в выдыхаемом   воздухе судят о наличии микробной уреазы в организме человека. Контроль процесса гидролиза меченной изотопными маркерами мочевины в выдыхаемом CO2 [7,8,10] проводят различными физико-химическими методами. Методики являются усложненными вариантами биохимического уреазного теста, построенного на ферментативном гидролизе карбамида микробной уреазой хеликобактера. Их чувствительность достигает 96-99 %, а специфичность - 98 % [7,10]. Но использование радиоактивного  в детской практике ограничено, а определение  связано не только с эксплуатацией дорогостоящего оборудования, например масс-спектрометра, но и проходит на фоне некоторого естественного базального содержания  в воздухе.

 

Методика относится к кинетическим методам анализа и основана на контроле временного качественного отличия воздуха выдыхаемого пациентом в случае наличия у него инвазии хеликобактера от воздуха, который выдыхает здоровый пациент. Качественное отличие измеряемых параметров (то есть существенное отличие характеристик на несколько порядков в измеряемом параметре) является по сравнению с количественным различием параметров (а в действительности  с измерением количественного соотношения измеряемого параметра в пределах одного двух порядков измеряемой величины с общей погрешностью от 10 до 25%) более высоким уровнем дифференциации контролируемых характеристик и позволяет получить более достоверную и надёжную информацию.

Поэтому такие методики и подходы за последнее время прочно вошли в арсенал диагностических методов неинвазивной диагностики многих заболеваний. Одновременно с внедрением метода основанного на применении изотопных маркеров  в отечественной практике нашли применение похожие методики построенные на аналогичных принципах, но без применения изотопных маркеров. 

Первым успешно внедрённым в медицинскую практику ещё в 1992 году  была методика с авторским названием "Аэротест"[4,11,13]. "Аэротест" основан на определении естественного содержания аммиака в воздухе ротовой полости (фоновой концентрации - ) без внесения мочевины извне. В наиболее распространённом варианте методики  регистрируют с помощью высокочувствительных одноразовых линейных газоанализаторов – индикаторных трубок (ИТ) , как среднюю величину текущих концентраций за время анализа. В качестве параметра, свидетельствующего об инвазии НР (НР+), для методики «Аэротест» была выбрана , превышающая

Модификация "Аэротест" приемом бикарбоната натрия [11, 16] делает результат исследования более наглядным, так как , вследствие нейтрализации соляной кислоты в желудке, приводит к сдвигу кислотно-основного равновесия (2) и высвобождению аммиака из аммонийных солей. Так, например, через 1-2 минуты после приема 5 г бикарбонат натрия  временно увеличивается в 2-3 раза и нормализуется через 20-40 минут. Поэтому тест с бикарбонатом натрия отличается более высокой чувствительностью, но также не является строго специфичным. 

 

Исследования показали, что  зависит не только от инвазии НР, но и от ряда других факторов: особенностей азотистого обмена, желудочной секреции, функционального состояния печени, активности продуцентов уреазы кишечного биоценоза. Тем не менее, метод  хорошо определяет эрозивные состояния в активной фазе и ориентирован именно на диагностику язвенной болезни, ассоциированной с НР, а не на хеликобактериоз как таковой.

В дальнейшем в России [2, 18] разработан биохимический тест измерения уреазной активности in vivo с авторским названием ХЕЛИК-тест (ГЕЛИК-тест). Он основан на оценке прироста концентрации аммиака  в воздухе ротовой полости после приема пациентом мочевины нормального изотопного состава . Мочевина быстро гидролизуется под действием уреазы НР и вызывает изменение содержания аммиака в воздухе (рис. 1). 

 
Рис. 1. Повышение содержания аммиака связанное с приёмом 0,5 грамм карбамида.


Для оценки скорости этого процесса  на первом этапе исследования был изучен характер изменения концентрации аммиака в воздухе ротовой полости после приема мочевины () у 26 пациентов. Результаты измерений концентрации аммиака в течение 20-40 мин со сменой индикаторных трубок каждые 3 минуты (рис. 2) показали, что у явно инфицированных больных существенное увеличение  отмечается уже на третей минуте, достигает максимума через 6-10 мин и снижается до фонового уровня через 25-30 мин (рис. 2). Руководствуясь этими результатами при проведении ХЕЛИК-теста,  рекомендуется измерять и оценивать со 2-ой по 12-ую минуту.

 
Рис. 2. Динамика временного повышения содержания аммиака в воздухе после приёма 0,5 грамм карбамида.


Для оценки зависимости изменения от дозы мочевины были проведены исследования у добровольцев с многократным приемом 200 мг, 500 мг, 1 г  и  2  г  мочевины. Чтобы исключить влияние других возможных факторов, в частности, пищевых, исследование проводили натощак. При повторном приеме одной и той же дозы мочевины одним и тем же пациентом зависимость воспроизводилась. Большей дозе соответствовало большее ∆С=-. Таким образом, при проведении теста необходима точная дозировка количества мочевины. Значимое ∆С без каких-либо неприятных ощущений у больного создает 500 мг. Приведенные ниже нормативы представлены именно для этого оптимального количества (рис 3-5). 

 
Рис. 3. Номограмма оценки наличия хеликобактериоза по приросту аммиака для индикаторных трубок ИТМ-12.


 
Рис. 4. Номограмма оценки наличия хеликобактериоза по приросту аммиака для индикаторных трубок ИТМ-12эо.


 
Рис. 5. Номограмма оценки наличия хеликобактериоза по приросту аммиака для индикаторных трубок .

Для отработки этих нормативов были сопоставлены данные, полученные с помощью спектрометра ионного дрейфа (СИД) производства ООО «ЛБМ» Cанкт-Петербург, с данными полученными с использованием индикаторных трубок ИТМ-12 (рис. 6) у 124 пациентов с различными вариантами гастродуоденальной патологии и сравнили их с аналогичными показателями 18 детей контрольной группы. 


 
Рис. 6. Сравнительные показатели изменения содержания аммиака в воздухе, выдыхаемом пациентом, по результатам измерений ион-дрейфовым спектрометром и индикаторными трубками ИТМ-12.


СИД  использовали для того, чтобы  детально изучить изменение моментальных . Методика, позволяющая судить об этом, выглядела следующим образом. Первоначально регистрировали спектр окружающего воздуха и , как среднюю величину из трех моментальных измерений. После чего пациент принимал 500 мг мочевины нормального изотопного состава в 15-20 мл дистиллированной воды и ополаскивал рот водой. Затем каждые 30 с в течение 20-40 мин регистрировали мгновенные значения

Исследования, проведённые с помощью ИДС, показали, что увеличение содержания аммиака после приёма мочевины фиксируется на выдохе. Это свидетельствует о выделении аммиака с выдыхаемым воздухом. Увеличение содержания аммиака в воздухе обычно наблюдается через 2-3 мин с момента приёма мочевины и зависимость  от  может иметь несколько максимумов, быть более крутой или более пологой.  Профиль кинетических кривых для усредненных значений , полученных с помощью ИДС, в целом соответствовал зависимостям установленным с помощью индикаторных трубок (Рис-6).

У детей контрольной группы существенного увеличения текущих концентраций аммиака  после приёма мочевины не наблюдалось. Те же данные получены при обследовании пациентов страдающих гастродуоденальной патологией у которых НР не был обнаружен традиционными диагностическими методиками (НР-). У всех НР(+) больных получено отчётливое нарастание концентрации аммиака после приёма мочевины, характеризующееся высокими моментальными значениями с 3-ей по 12-ую мин. Профиль кинетической зависимости  от времени имел один или несколько максимумов. Наиболее высокие (пиковые) величины  получены у некоторых больных язвенной болезнью.

Анализ полученных зависимостей позволяет упростить процедуру исследования для применения в широкой практике с использованием индикаторных трубок. Один из упрощенных и широко апробированных вариантов  диагностической методики ХЕЛИК-тест может выглядеть так. 

Сначала у каждого пациента натощак измеряют . Затем обследуемый принимает 500 мг мочевины в 15-20 мл дистиллированной воды  и прополаскивает рот водой. Через 2 минуты после приема мочевины в течение 4-6 минут у пациента отбирают воздух из ротовой полости и оценивают . Оценка проводится по нарастанию длины окрашенного столбика в индикаторной трубке после приема мочевины, 1 мм длины столбика равен 0,3 . В случае использования трубки ИТМ-12 или ИТМ-12эо (рис 7).

 
Рис. 7. Индикаторные трубки ИТМ-12эо.


По данным ранних исследований [17-19] у детей контрольной группы средняя величина =(0,3±0,1) , =(0,4±0,2) ,при среднем приросте концентрации ∆C=(0,10±0,05) . У HP-негативных (НР-) больных с различными вариантами хронического гастрита   в среднем составила (0,4±0,2) составила (0,6±0,2) , а ∆C  -  (0,2±0,1)  , что  мало отличается от  показателей контрольной группы (P>0,1). У детей с НР-ассоциированной гастородуоденальной патологией  составила (0,5±0,2) , что мало отличается от показателей контрольной группы. Причём у 60% НР+ больных этой группы  не превышала 0, 5  – минимального норматива для модификации «Аэротеста» [3]. После приема мочевины у всех НР+ пациентов отмечалось существенное нарастание содержания аммиака в воздухе ротовой полости:  составила (1,7±0,3) , ∆С – (1,2±0,3) . Различия между показателями (  и ∆С) для НР+ обследуемых и аналогичными показателями для пациентов контрольной группы и НР- достоверны ( Р 0,01). 

Сопоставление индивидуальных  и  у каждого больного не выявило зависимости величины нагрузочных показателей от исходных. Корреляция между ними  отсутствовала. Таким образом, именно прирост концентрации аммиака в воздухе ротовой полости и её абсолютные значения после приёма мочевины могут служить достоверными критериями инфицированности НР.

На основании полученных данных нами отработаны нормативы ХЕЛИК-теста [17,18]: результат считается положительным, если после приёма 500 мг мочевины средневзвешенная или моментальная  превышает 0,9 при ∆С более 0,5 .

При сопоставлении с другими методами диагностики: гистологическим и уреазным тестом, ХЕЛИК-тест оказался весьма информативным. Его чувствительность составила 97%, а специфичность - 96%. 

У всех обследованных результаты ИДС сопоставлены с данными уреазного теста и гистологического исследования, сопоставление показало высокую чувствительность и специфичность методики - 98%. Сопоставление результатов двух существенно отличающихся между собой аналитических методик (ИДС и ИТ) в рамках диагностического метода ХЕЛИК-тест, выявило принципиальное совпадение результатов в абсолютном большинстве случаев. Коэффициент корреляции составил - 0,9. Неполное совпадение результатов полученных с помощью СИД и ИТ объясняется тем, что результат измерения посредством ИТ отражает усредненный показатель за время исследования, а величина , измеренная СИД оценивает кинетику гидролиза мочевины по группе моментальных значений . Поэтому при кратковременном повышении , наблюдавшемся у ряда НР+ больных, интегральные показатели , измеренные ИТ, ниже пиковых значений по ИДС. С другой стороны, дискретность измерения СИД требует проведения отбора пробы воздуха строго на  выдохе, что не всегда удаётся у детей.

Изменения  показателей ХЕЛИК-теста (ИДС и ИТ) в ходе курса антихеликобактериозной терапии у 58 больных с различными вариантами НР-ассоциированных гастродуоденальных заболеваний. Оценка проводилась на 7, 14 день терапии и через 4 недели после окончания курса лечения. При неэффективности терапии оставалась высокой при  каждом обследовании. Часто на фоне лечения происходило снижение или нормализация показателей, что свидетельствовало о подавлении НР. Окончательный вывод об эффективности терапии можно было сделать только через 4 недели после её завершения: в случаях эрадикации НР , измеренная ИТ, оказывалась в пределах нормы, а спектры ионного дрейфа не фиксировали значимых моментальных показателей. Это находилось в соответствии с отрицательным результатами уреазного теста и гистологического исследования. 

ХЕЛИК-тест является простым и информативным методом диагностики НР и пригоден, как для первичного обследования и динамического наблюдения за больным, так и контроля терапии. Высокие значения чувствительности (97 %) и специфичности (96 %) ХЕЛИК-теста соответствуют таковым у зарубежных дыхательных тестов [7,8,10]. Предложенная нами кинетическая методика оценки скорости ферментативного гидролиза мочевины in vivo по диагностическим результатам оценки уреазной активности НР совпадает с результатами быстрого углеродного дыхательного теста [6,9].

В отличие от зарубежных углеродных дыхательных тестов варианты ХЕЛИК-теста не требуют использования радиоактивных или других изотопных маркеров. Метод прост, дешев, не требует специальной подготовки и дорогостоящей аппаратуры, результат оценивается непосредственно в ходе исследования, что позволяет максимально быстро назначить необходимое лечение. Простота, информативность и доступность ХЕЛИК-теста делают его весьма перспективным для широкого внедрения в медицинскую практику.

Однако, с внедрением метода возникли проблемы, связанные с консервативным неприятем метода, обладающим высокими характеристиками по сравнению с на тот момент существовавшими методиками, часть из которых считалась общепринятыми. Поэтому для поддержки метода была разработана новая высокочувствительная методика экспресс-диагностики, позволяющая оценить уреазную активность биоптата, полученного в ходе эзофагогастродуоденоскопии, с высокой чувствительностью и специфичностью к микробной уреазе бактерии Helicobacter pylori. Методика получила авторское название - ХЕЛПИЛ-тест [20]. 

Тест система для выполнения методики ХЕЛПИЛ-тест представляет собой впитывающую салфетку из волокнистого материала (бумага, нетканый или текстильный материал) пропитанную карбамидом и кислотно-основным индикатором Бромтимоловым синим и специфическими добавками (НОУ-ХАУ). Тесты в виде индикаторной бумаги выпускаются под названием Геликобактер-тест (рис. 8) и ХЕЛПИЛ®. Диски  из бумаги или из текстильного материала (HelPil-test) могут быть закреплены на держатели из инертного материала различным образом (рис. 9-11): на инертный держатель из поливинилхлорида, на ламинированный териленом картон, в лунке из ламинированого картона на полимерную плёнку из полиэтилена. Все изделия срабатывают на присутствие уреазы в очень короткие временные интервалы: от 15 секунд до 3 минут. Индикационный эффект в месте контакта биоптата с поверхностью впитывающего диска развивается во времени, как по габаритным размерам, так и по интенсивности окраски в синий цвет (рис.12). Разработанный новый уреазный тест (ХЕЛПИЛ-тест) имел высокие характеристики по специфичности и чувствительности, совпадающие с таковыми у ХЕЛИК-теста в авторском исполнении того времени. Это позволило эффективно внедрить комплекс диагностических методик в отечественную практику. Предлагаемый способ диагностики, также как и дыхательная диагностика АЭРОТЕСТ и ХЕЛИК-тест, являлся оригинальной разработкой и был запатентован [21, 22]. Индикаторные трубки близкие по свойствам к индикаторным трубкам ИТМ-12 (стеклянный корпус) и ИТМ-12эо (корпус из полипропилена) в настоящее время выпускает ООО «АМА» (Санкт-Петербург) под торговой маркой ХЕЛИК®. Эти трубки имеют полипропиленовый корпус и слой хромогенного адсорбента длинной около 30 мм.

 
Рис. 8. Впитывающие диски для выполнения методики ХЕЛПИЛ-тест.


 
Рис. 9. Впитывающий диск для выполнения методики ХЕЛПИЛ-тест, закрепленный в «лунке».


 
Рис. 10. Впитывающий диск для выполнения методики ХЕЛПИЛ-тест, закрепленный на прозрачной плёнке ПВХ.


 
Рис. 11. Впитывающий диск для выполнения методики ХЕЛПИЛ-тест, закрепленный на ламинированном картоне. 


 

Рис. 12. Индикационный эффект развивающийся во времени на впитывающем диске из бумаги в случае высокой уреазной активности биоптата.

Дальнейшее развитие  метода пошло, как  по пути приборов с электрохимическими датчиками, так и по пути развития методики с индикаторными трубками с более высокой чувствительностью по отношению к аммиаку: индикаторная трубка  (ранее выпускавшаяся ООО «Синтана СМ» (рис. 13) и индикаторная трубка (выпускается SIA «MED PRO», Латвия).

 
Рис. 13. Индикаторные трубки .


Такие  высокочувствительные по отношению к аммиаку линейные газоанализаторы применительно к методике ХЕЛИК-тест позволяют упростить её за счёт сокращения объёма пробы воздуха до 20-60 мл и позволяют создать методику анализа, способную оценить присутствие бактерии быстро и атравматично. Общее время анализа не превышает пяти минут, причём проботбор (до экспозиции и после неё) не занимает более одной минуты и выполняется обычным медицинским шприцем. Как и в описанном выше случае выполнения методики с индикаторными трубками ИТМ-12 и ИТМ-12эо или ХЕЛИК®, исследование выполняется натощак, а индикационные эффекты, полученные до и после нагрузки карбамидом (рис. 14), сопоставляются между собой с использованием номограммы (рис. 5). При этом метод позволяет судить и о наличии заражения Лямблиями в присутствии НР [23].

  
Рис. 14. Индикационный эффект на индикаторной трубке , характерный для пациента с инвазией НР.


Таким образом, в Российской Федерации  существует оригинальный комплекс методик отечественной разработки, который  весьма успешно может использоваться для экспресс-диагностики хеликобактериоза одноразовыми тест-системами диагностики доступными по цене без ущерба в качестве исследования. Причём, неинвазивный и атравматичный «дыхательный» метод может использоваться многократно без неприятных ощущений, связанных с процедурой эзофагогастродуоденоскопии, как для скрининговой диагностики, так и для корректировки и контроля терапии. Метод с индикатоными трубками может использоваться свободно, так как защита этого способа диагностики утратила силу.  В то же самое время методика ХЕЛПИЛ-тест, как способ диагностики,  и изделия для её выполнения попадают по защиту исключительных прав на результат интеллектуальной дечтельности согласно ГК РФ (статья1233), так как патент на способ и устройство для его осуществления действует до 30 сентября 2017 года. Патент [21] и на настоящее время поддерживается в силе. В соответствии с законодательством РФ и, в частности, со ст. 1229, ст. 1233 ГК РФ, патентообладателям принадлежат исключительные права: «…на результат интеллектуальной деятельности или на средство индивидуализации». В том числе: «Правообладатель может по своему усмотрению разрешать или запрещать другим лицам использование результата интеллектуальной деятельности или средства индивидуализации. Отсутствие запрета не считается согласием (разрешением)». Нарушение прав патентообладателя, то есть использование промышленной собственности (в данном случае способа диагностики или устройства для его осуществления), защищаемой патентом РФ на территории РФ,  без официально оформленной лицензии  со стороны патентообладателей является нарушением. При этом, как использование способа без лицензии, так и изготовление устройств для осуществления способа, вне зависимости от наличия на эту продукцию регистрационных удостоверений, сертификатов, паспортов и деклараций может быть признана по суду фактом, нарушающим права патентообладателей, а продукция, соответственно, контрафактной со всеми вытекающими из этого последствиями.


СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Аруин Л.И., Григорьев П.Я., Исаков В.А., Яковенко  Э.П. Хронический гастрит.- Амстердам, 1993.
2. Корниенко Е.А., Милейко В.Е.// Диагностика и лечение.- Архангельск, 1996, II(12), с 31- 33.
3. Милейко В. Е., Сафонова Н.В., Жебрун А.Б. и др.// Актуальные проблемы инфекционной патологии.-СПб, 1993.-С. 43.
4. Корниенко Е.А., Милейко В.Е., Фадина С.А., Нажиганов О.Н.//Фарминдекс.-1997.-№ 20(36).-С А-29 – А-30.
5. Сафонова Н.В., Жебрун А.Б. Гастрит, язвенная болезнь и хеликобактериоз.- СПб,1993.
6. Байбаков Ф.Б., Шарапов В.М. Контроль примесей в сжатых газах.-М.,1989.
7. Hamlet A.K., Erandsson K.I.M., Olbe L. et al.// Scandinav. J. Gastroenterol.-1995.- Vol. 30, №. 11.-P. 1058-1063.
8. Hill H.H., Siems W. F., St. Louis R. H., McMinn D.G.//Analyical Chemistry.-1990.-Vol. 62,№ 23.- P. 1201 A – 1209 A.
9. Kornienko E., Vashkevich O., Samokish V.//Abstracts of International Congress on Analytical Chemistry.-Moscow,1997. P-37.
10. Logan R.P.H., Dill S., Bauer F.E. et al.// Eur. J. Gastroenterol. Hepatol.-1991.-Vol. 3.-P. 915-921.
11. Marshall B.J., Survejor I.// J. Nucl. Med. – 1988.- Vol. 29.- P. 11-16.
12. Perua D.A., Pambianco D.J., Dye K.R. et al. //Am. J. Gastro.- 1996.-Vol. 91, № 2. - P. 233-238.
13. Safonova N.V., Meelaiko V.E., Zhebrun A.B.  et al //Helicobacter pylori and the new concepts in gastro-duodenal diseases.-Prague, 1992.- P. P-3.
14. Walsh J.H.,  Peterson W.L.// New England J. Med. – 1995.- Vol. 333, №15.- P. 984-991.
15. Zhebrun A.B., Safonova N.V., Mileiko V.E. et al. //Acta Gastroenterol. Belg.- 1993.- Vol.. 56.- P. 8.
16.  Ito Masaharu, Matsunobu kunitoshi, Uno Masanori, Kanemaki Susumu, Kobashi Kyoichi. US Pat. 5719052 11.01.1996// Simple examination method of infection with Helicobacter pylori and device therefor. 17.02.1998. - Japan Pat. 07289289 pub. 07.11.1995. Appl. 06089515, filing 27.04.1994.
17.  Корниенко Е.А., Милейко В.Е., RU 2100010  C 01. 27.12.1997. Способ неинвазивной диагностики хеликобактериоза ин виво. Приоритет от 20.02.1996
18.  Корниенко Е. А., Милейко В. Е. //ГЕЛИК-тест – неинвазивный метод диагностики геликобактериоза – «Российский журнал гастроэтерологии, гепатологии и колопроктологии», 1998, №6, с.34-38,
19. Корниенко Е.А., Милейко В.Е., Самокиш В.А., Нажиганов О.Н.// НЕИНВАЗИВНЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ HELICOBACTER PYLORI. Педиатрия № 1, 1999, с 37-40 .
20. Корниенко Е.А., Милейко В.Е., М.А., Самокиш В.А. //Комплекс биохимических методов диагностики Helicobacter pylori. - «Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии», 1998, №5(VIII), приложение №5, с 280-228.
21.  Корниенко Е.А., Дмитриенко М.А., Милейко В.Е.,   RU 2100010  C 02. 10.07.2002. Способ диагностики хеликобактериоза по оценке уреазной активности биологического материала и устройство для его осуществления. Приоритет от 30.09.1997.
22.  Денисова Е.В., Курбатова Э.А., Милейко В.Е. Оценка диагностических результатов методами визуализации с последующей автоматизированной компьютерной верификацией.- с 95-97. // в сб. Школа-семинар «Актуальные проблемы современной хирургии» СПб, НИИХимии СпбГУ, 2000.- 152 с.
23.  Кильдиярова Р.Р., Милейко В.Е. //Диагностика и контроль лямблиоза у детей.-  «Здоровье, демография, экология финно-угорских народов» - 2014, № 4, с 35-39.

© 2012 Меднавигатор.рф, Санкт-Петербург Обратная связь